biophBiomedical PhotonicsBiomedical Photonics2413-9432Non-profit partnership for development of domestic photodynamic therapy and photodiagnosis10.24931/2413-9432-2015-4-3-3-9bioph-66Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESЛазерный микроскоп-спектроанализатор для исследования внутриклеточного накопления фотосенсибилизаторов ближнего инфракрасного диапазона спектра in vitroLaser microscope-spectrum analyzer for studying intracellular accumulation of near infrared emitting photosensitizers in vitroМаклыгинаЮ. С.MaklyginaYu. S.БородкинА. В.BorodkinA. V.ЛощеновВ. Б.LoschenovV. B.loschenov@mail.ruИнститут общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва, РоссияРоссияFSBIS «A.M. Prokhorov Institute of General Physics» of RAS, Moscow, RussiaRussian FederationИнститут общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва, РоссияРоссияFSBIS «A.M. Prokhorov Institute of General Physics» of RAS, Moscow, RussiaRussian FederationИнститут общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва, Россия; Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ, Москва, РоссияРоссияFSBIS «A.M. Prokhorov Institute of General Physics» of RAS, Moscow, RussiaRussian Federation2015200920154339Copyright © Маклыгина Ю.С., Бородкин А.В., Лощенов В.Б., 20152015Маклыгина Ю.С., Бородкин А.В., Лощенов В.Б.Maklygina Y.S., Borodkin A.V., Loschenov V.B.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.pdt-journal.com/jour/article/view/66

Разработан измерительный комплекс на базе бинокулярного микроскопа для анализа внутриклеточного накопления фотосенсибилизаторов ИК-диапазона, который дает возможность получить графическую информацию о состоянии исследуемых объектов, о локализации очагов флуоресценции, а также сведения о спектральном составе флуоресцирующих центров в ИК-области спектра. По картине распределения флуоресцентного сигнала можно точно определить локализацию накопления фотосенсибилизатора внутри клетки и получить спектр флуоресцентного сигнала ближнего ИК-диапазона в заданной точке. Разработанная система достаточно универсальна, поскольку дает возможность выбора технических параметров, режимов работы, методов измерения и анализа. Преимуществом разработанного микроскопа-спектроанализатора является возможность с помощью лазерного источника с малой угловой расходимостью луча сфокусировать излучение и этим создать большую плотность мощности на облучаемом участке, что позволяет проводить сверхтонкие операции на клетках. При этом перестраиваемый размер открытия диафрагмы в дальнем поле позволяет зарегистрировать сигнал флуоресценции на отдельных органеллах клеток. При помощи разработанной системы на клеточной линии HeLa проведены исследования накопления нового фотосенсибилизатора ряда бактериохлоринов. Система позволила зафиксировать скопления раковых клеток с четко выраженными центрами избирательно накопленного фотосенсибилизатора. Очаги флуоресценции представляли собой центры накопления фотосенсибилизатора бактериохлорина, откуда можно сделать вывод, что исследуемый фотосенсибилизатор имеет тенденцию к локальному накоплению внутри органелл клеток. Авторы предполагают, что использование разработанной системы позволит осуществлять эффективный и быстрый скрининг новых фотосенсибилизаторов, в частности ИК-фотосенсибилизаторов бактериохлоринового ряда.

 

Measuring system based on the binocular microscope for analysis of intracellular accumulation of infrared IR photosenstizers allowing to obtain graphic data about state of analyzed objects, location of fluorescence foci and to obtain details of spectral profile of fluorescence emission centers in IR spectral region was developed. According to image of fluorescence signal distribution the location of photosensitizer accumulation in the cell may be detected accurately and the spectrum of fluorescence signal of near IR-range in the targeted point may be obtained. The developed system is quite comprehensive because there is an opportunity to choose technical parameters, operating modes, measuring methods and analysis. The advantage of the developed microscope-spectrum analyzer is an opportunity to focus emission and create high power intensity on the irradiated area by means of laser source with small-angle beam spreading, all this allow to perform ultra-precise operations with cells. Particularly, tunable size of the diaphragm opening in the far field allows to register fluorescence signal on certain cell organoids. By means of developed system the studies of accumulation of the new bacteriochlorine photosensitizers on HeLa cell line were performed. The system allowed to register accumulation of cancer cells with definite sites of selectively accumulated photosensitizer. The sites of fluorescence were the centers of accumulation of bacteriochlorine photosensitizer, this suggests that studied photosensitizer has a tendency for local accumulation in cellular organoids. The authors suggested that the developed system allowed to perform the effective and rapid screening of new photosensitizers, particularly IR bacteriochlorine photosensitizers.

 

микроскоп-спектроанализаторфлуоресценциябактериохлоринфотосенсибилизаторmicroscope-spectrum analyzerfluorescencebacteriochlorinephotosensitizerReferencesLoschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics // Laser Physics. – 2000. – Vol. 10, No 6. – Р. 1188–1207.Loschenov V.B., Konov V.I., Prokhorov A.M. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics, Laser Physics, 2000, Vol. 10, No. 6, pp. 1188–1207.Филоненко Е.В. Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия – обоснование применения и возможности в онкологии // Фотодинамическая терапия и фотодиагностика. – 2014. – № 1. – С. 3–7.Filonenko E.V. Flyuorestsentnaya diagnostika i fotodinamicheskaya terapiya – obosnovanie primeneniya i vozmozhnosti v onkologii (Fluorescence diagnosis and photodynamic therapy – justification of use and opportunities in oncology), Fotodinamicheskaya terapiya i fotodiagnostika, 2014, No. 1, pp. 3–7.Линьков К.Г., Березин А.Н., Лощенов В.Б. Аппаратура для ФД и ФДТ // Росс. биотерапевт. журнал. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 54.Lin'kov K.G., Berezin A.N., Loshchenov V.B. Apparatura dlya FD i FDT (Devices for FD and PDT), Ross. bioterapevt. zhurnal, 2004, T. 3, No. 2, p. 54.Меерович И. Г., Грин М. А., Меерович Г. А. и др. Новые фотосен- сибилизаторы ближнего инфракрасного диапазоне на основе производных бактериохлорина: предварительные результаты изучения in vivo // Росс. биотерапевт. журнал. – 2006.– Т. 5, № 2. – С. 73–76.Meerovich I. G., Grin M. A., Meerovich G. A. i dr. Novye fotosensibilizatory blizhnego infrakrasnogo diapazone na osnove proizvodnykh bakteriokhlorina: predvaritel'nye rezul'taty izucheniya in vivo (New bacteriochlorine-based photosensitizers of near infrared range: preliminary results of study in vivo), Ross. bioterapevt. zhurnal, 2006, T. 5, No. 2, pp. 73–76.Vasilchenko S.Yu., Volkova A.I., Ryabova A.V. et al. Application of aluminum phthalocyanine nanoparticles for fluorescent diagnostics in dentistry and skin autotransplantology // J. Biophoton. – 2010. – Т. 3, No 5–6. – Р. 336–346.Vasilchenko S.Yu., Volkova A.I., Ryabova A.V. et al. Application of aluminum phthalocyanine nanoparticles for fluorescent diagnostics in dentistry and skin autotransplantology, J. Biophoton., 2010, Т. 3, No. 5–6, pp. 336–346.Breymayer J., Rück A., Ryabova A.V., Loschenov V.B., Steiner R.W. Fluorescence Investigation of the Effect of Monocytes/ Macrophages and Skin Cells on Aluminium Phthalocyanine Nanoparticles // Journal Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. – 2014 – Vol. 11(3). – P. 380–390.Breymayer J., Rück A., Ryabova A.V., Loschenov V.B., Steiner R.W. Fluorescence Investigation of the Effect of Monocytes/Macrophages and Skin Cells on Aluminium Phthalocyanine Nanoparticles, Journal Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, 2014, Vol. 11 (3), pp. 380–390.Рябова А.В., Поминова Д.В., Климов А.И. и др. Эффективность генерации синглетного кислорода фталоцианинами Al и Zn и их фотодинамическая активность при конъюгировании с наночастицами Au, Ag, Fe2O3, Si // Российский химический журнал. – 2013. – Т. LVII, № 5. – C. 25–34.Ryabova A.V., Pominova D.V., Klimov A.I. i dr. Effektivnost' generatsii singletnogo kisloroda ftalotsianinami Al i Zn i ikh fotodinamicheskaya aktivnost' pri kon"yugirovanii s nanochastitsami Au, Ag, Fe2O3, Si (Efficiency of singlet oxygen generation by Al and Zn phthalocyanines and its photodynamic activity for conjugation with nano-particles of Au, Ag, Fe2O3, Si), Rossiiskii khimicheskii zhurnal, 2013, T. LVII, No. 5, pp. 25–34.Oertel, M., Schastak S. I., Tannapfel A. et al. Novel bacteriochlorin for high tissue-penetration: photodynamic properties in human biliary tract cancer cells in vitro and in a mouse tumour model // J. Photochem. Photobiol. – 2003. – Vol. 71. – P. 1–10.Oertel, M., Schastak S. I., Tannapfel A. et al. Novel bacteriochlorin for high tissue-penetration: photodynamic properties in human biliary tract cancer cells in vitro and in a mouse tumour model, J. Photochem. Photobiol., 2003, Vol. 71, pp. 1–10.Mazor O., Brandis A., Plaks, V., Neumark, E. et al. WST11, a novel water-soluble bacteriochlorophyll derivative; cellular uptake, pharmacokinetics, biodistribution, and vascular targeted photodynamic activity against melanoma tumors // Photochem. Photobiol. – 2005. – Vol. 81. – P. 342351.Mazor O., Brandis A., Plaks, V., Neumark, E. et al. WST11, a novel water-soluble bacteriochlorophyll derivative; cellular uptake, pharmacokinetics, biodistribution, and vascular targeted photodynamic activity against melanoma tumors, Photochem. Photobiol., 2005, Vol. 81, pp. 342–351.Rovers J. P., de Jode M.L., Rezzoug H., Grahn M.F. In vivo photodynamic characteristics of the near-infrared photosensitizer 5,10,15,20-tetrakis(m-hydroxyphenyl) bacteriochlorin // Photochem. Photobiol. – 2000. – Vol. 72. – P. 358-364.Rovers J. P., de Jode M.L., Rezzoug H., Grahn M.F. In vivo photodynamic characteristics of the near-infrared photosensitizer 5,10,15,20-tetrakis(m-hydroxyphenyl)bacteriochlorin, Photochem. Photobiol., 2000, Vol. 72, pp. 358–364.Миронов А.Ф., Грин М.А., Кармакова Т.А. и др. Новые фото- сенсибилизаторы для ФДТ рака на основе природного бактериохлорофилла a // Росс. биотерапевт. журнал. – 2003. – Т. 2, № 1. – С. 33–34.Mironov A.F., Grin M.A., Karmakova T.A. i dr. Novye fotosensibilizatory dlya FDT raka na osnove prirodnogo bakteriokhlorofilla a (New natural bacteriochlorophyl a based photosensitizers for PDT cancer), Ross. bioterapevt. zhurnal, 2003, T. 2, No. 1, pp. 33–34.Якубовская Р.И., Плотникова Е.А., Морозова Н.Б., Грин М.А., Миронов А.Ф. Аминоамиды в ряду бактериохлорофилла а и их фотоиндуцированная активность в системах in vitro и in vivo // Фотодинамическая терапия и фотодиагностика. – 2013. – № 3. – С. 29–30.Yakubovskaya R.I., Plotnikova E.A., Morozova N.B., Grin M.A., Mironov A.F. Aminoamidy v ryadu bakteriokhlorofilla a i ikh fotoindutsirovannaya aktivnost' v sistemakh in vitro i in vivo (Aminoamids in the range of bacteriochlorophyl a and its photoinduced activity in systems in vitro and in vivo), Fotodinamicheskaya terapiya i fotodiagnostika, 2013, No. 3, pp. 29–30.Грин М.А., Пантюшенко И.В., Плотникова Е.А. и др. Новые фотосенсибилизаторы на основе бактериопурпуринимида и их фотоиндуцированная противоопухолевая активность // Фото- динамическая терапия и фотодиагностика. – 2013. – № 3. – С. 33–34.Grin M.A., Pantyushenko I.V., Plotnikova E.A. i dr. Novye fotosensibilizatory na osnove bakteriopurpurinimida i ikh fotoindutsirovannaya protivoopukholevaya aktivnost' (New bacteriopurpurinimide-based photosensitizers and its photoinduced anti-cancer activity), Fotodinamicheskaya terapiya i fotodiagnostika, 2013, No. 3, pp. 33–34.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.