Исследование степени фотоокисления липофусцина методами видимой спектроскопии и время-коррелированной флуоресцентной микроскопии

Исследование посвящено разработке раннего доклинического метода диагностики возрастной макулярной дегенерации с использованием данных время-коррелированной флуоресцентной микроскопии и видимой спектроскопии при анализе кинетик затухания и спектров флуоресценции для липофусциновых гранул. Липофусциновые гранулы были получены из клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека без признаков патологии. Для изучения кинетики затухания флуоресценции липофусциновых гранул использовали метод возбуждения флуоресценции с усредненной по образцу корреляцией по времени и метод время-разрешенной флуоресцентной визуализированной микроскопии (FLIM) в сочетании со сверхпроводниковым однофотонным детектором. В качестве модели возрастной макулярной дегенерации использовали фотоокисленные гранулы. Сравнительный анализ кинетик затухания и спектров флуоресценции до и после фотоокисления липофусциновых гранул показал достоверные различия характерных времен жизни, а также смещение максимума спектра флуоресценции в коротковолновую область по мере окисления образцов. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что для разработки метода спектрально-кинетического анализа аутофлуоресценции глазного дна необходимо учитывать изменение вклада τ2 и τ3 компонент разложения кинетической кривой затухания флуоресценции τm с наибольшим характерным временем жизни и смещение пика спектра флуоресценции. Такой подход позволит определить диагностические критерии для нормы и патологии при диагностике дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия. Анализ полученных данных показал, что метод FLIM, может стать перспективным для разработки раннего доклинического метода диагностики возрастной макулярной дегенерации сетчатки.

1. Rózanowska M.B. Lipofuscin, its origin, properties, and contribution to retinal fluorescence as a potential biomarker of oxidative damage to the retina // Antioxidants. – 2023. – Vol. 12. – P. 2111. doi: 10.3390/antiox12122111.

2. Dorey K.C., Wu G., Ebensrein D., Garsd A. Cell loss in the aging retina: relationship to lipofuscin accumulation and macular degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1989. – Vol. 30. – P. 1691–1699. doi: 10.1016/S0161-8105(89)31221-5.

3. Schmitz-Valckenberg S., Holz F.G., Fitzke F.W. Perspectives in imaging technologies // In: Holz F.G., Schmitz-Valckenberg S., Spaide R.F., Bird A.C. (Eds). Atlas of fundus autofluorescence imaging. – Berlin: Springer, 2007. – P. 331–338. doi: 10.1007/978-3-540-71994-6_19.

4. Sharifzadeh M., Gellermann W. Systems and methods for optical detection of lipofuscin concentration in a subject’s eye // US Patent. – 2011. – No. 7,914,147 B2.

5. Holz F.G., Schmitz-Valckenberg S., Spaide R.F., Bird A.C. Autofluorescence imaging. – Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 2007. – P. 342. doi: 10.1007/978-3-540-71994-6.

6. Holz F.G., Schutt F., Kopotz J. Inhibition of lysosomal degradative functions in RPE cells by a retinoid component of lipofuscin // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 1999. – Vol. 40. – P. 737. PMID: 10067978.

7. Eldred G.E., Lasky M.R. Retinal age pigments generated by self-assembling lysosomotropic detergents // Nature. – 1993. – Vol. 361. – P. 724. doi: 10.1038/361724a0.

8. Von Ruckmann A., Fitzke F.W., Bird A.C. In vivo fundus autofluorescence in macular dystrophies // Arch. Ophthalmol. – 1997. – Vol. 115. – P. 609–615. doi: 10.1001/archopht.1997.01100150611006.

9. Boulton M., Dontsov A., Jarvis-Evans J., Ostrovsky M., Svistunenko D. Lipofuscin is a photoinducible free radical generator // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. – 1993. – Vol. 19. – P. 201–204. doi: 10.1016/1011-1344(93)07173-3.

10. Yakovleva M.A., Feldman T.B., Krupennikova A.S., Borzenok S.A., Ostrovsky M.A. Fluorofory lipofuscinovych granul, otvetstvennie za autofluorescenciyu glaznogo dna cheloveka // Izvestiya Akademii Nauk. Seriya Khimicheskaya. – 2010. – No. 12. – P. 2252–2260.

11. Sparrow J.R., Vollmer-Snarr H.R., Zhou J. et al. A2E-epoxides damage DNA in retinal pigment epithelial cells. Vitamin E and other antioxidants inhibit A2E-epoxide formation // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, No. 20. – P. 18207–18213. doi: 10.1074/jbc.M300155200.

12. Feldman T.B., Yakovleva M.A., Arbukhanova P.M., Borzenok S.A., Kononikhin A.S., Popov I.A. et al. Changes in spectral properties and composition of lipofuscin fluorophores from human retinal pigment epithelium with age and pathology // Anal. Bioanal. Chem. – 2015. – Vol. 407. – P. 1075–1088. doi: 10.1007/s00216-014-8366-9.

13. FeldmanT.B.,Yakovleva M.A., Larichev A.V., Arbukhanova P.M., Radchenko A.Sh., Borzenok S.A., Kuzmin V.A., Ostrovsky M.A. Spectral analysis of fundus autofluorescence pattern as a tool to detect early stages of degeneration in the retina and retinal pigment epithelium // Eye. – 2018. – Vol. 32, No. 9. – P. 1440–1448. doi: 10.1038/s41433-018-0090-7.

14. Bourauel L.,Vaisband M.,Von der Emde L. et al. Spectral analysis of human retinal pigment epithelium cells in healthy and AMD eyes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2024. – Vol. 65. – P. 10. doi: 10.1167/iovs.65.1.10.

15. Yakovleva M.A., Radchenko A.Sh., Feldman T.B., Kostyukov A.A., Arbukhanova P.M., Borzenok S.A., Kuzmin V.A., Ostrovsky M.A. Fluorescence characteristics of lipofuscin fluorophores from human retinal pigment epithelium // Photochem. Photobiol. Sci. – 2020. – Vol. 19, No. 7. – P. 920–930. doi: 10.1039/C9PP00406H.

16. Schweitzer D., Quick S., Schenke S., Klemm M., Gehlert S., Hammer M., Jentsch S., Fischer J. Comparison of parameters of time-resolved autofluorescence between healthy subjects and patients suffering from early AMD // Ophthalmologe. – 2009. – Vol. 106. – P. 714–722. doi: 10.1007/s00347-009-1975-4.

17. Sauer L., Gensure R.H., Andersen K.M., Kreilkamp K.M., Hageman G.S., Hammer M., Bernstein P.S. Patterns of fundus autofluorescence lifetimes in eyes of individuals with non-exudative age-related macular degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2018. – Vol. 59. – P. AMD65. doi: 10.1167/iovs.17-23764.

18. Pawley J. (ed.). Handbook of biological confocal microscopy. 3rd. ed. – Springer, 2006. doi: 10.1007/978-0-387-45524-2.

19. Philip J.P., Carlsson K. Theoretical investigation of the signal-to-noise ratio in fluorescence lifetime imaging // J. Opt. Soc. Am. A. – 2003. – Vol. 9. – P. 368–379. doi: 10.1364/JOSAA.20.000368.

20. Becker W. Fluorescence lifetime imaging — techniques and applications // Vol. 247, Is. 2. – 2012. – P. 119–136. doi: 10.1111/j.1365-2818.2012.03618.x.

21. Smirnov K., Divochiy A., Vakhtomin Y., Morozov P., Zolotov P., Antipov A., Seleznev V. NbN single-photon detectors with saturated dependence of quantum efficiency // Superconductor Science and Technology. – 2018. – Vol. 31, No. 3. – P. 035011. doi: 10.1088/1361-6668/aaa56a.

22. Shcheslavskiy V., Morozov P., Divochiy A., Vakhtomin Yu., Smirnov K., Becker W. Ultrafast time measurements by time-correlated single photon counting coupled with superconducting single photon detector // Rev. Sci. Instrum. – 2016. – Vol. 87.– P. 053117. doi: 10.1063/1.4952963.

23. Wang S., Yin Z.-Q., He D.-Y., Chen W., Wang R.-Q., Ye P., Zhou Y., Fan-Yuan G.-J., Wang F.-X.. Zhu Y.-G., Morozov P.V., Divochiy A.V., Zhou Z., Guo G.-C., Han Z.-F. Twin-field quantum key distribution over 830-km fibre // Nature Photonics. – 2022. – Vol. 16. – P. 154–161. doi: 10.1038/s41566-021-00928-2.

24. Dontsov A., Yakovleva M., Trofimova N., Sakina N., Gulin A., Aybush A., Gostev F., Vasin A., Feldman T., Ostrovsky M. Water-soluble products of photooxidative destruction of the bisretinoid A2E cause proteins modification in the dark // Int. J. Mol. Sci. – 2022. – Vol. 23, No. 3. – P. 1534. doi: 10.3390/ijms23031534.

25. Docchio F., Boulton M., Cubeddu R., Ramponi R., Dayhaw-Barker P. Age-related changes in the fluorescence of melanin and lipofuscin granules of the retinal pigment epithelium: a time-resolved fluorescence spectroscopy study // Photochemistry and Photobiology. – 1991. – Vol. 54. – P. 247–253. doi: 10.1111/j.1751-1097.1991.tb02013.x.

26. Semenov A.N., Maksimov E.G., Moysenovich A.M., Yakovleva M.A., Tsoraev G.V., Ramonova A.A., Shirshin E.A., Sluchanko N.N., Feldman T.B., Rubin A.B., Kirpichnikov M.P., Ostrovsky M.A. Protein-mediated carotenoid delivery suppresses the photoinducible oxidation of lipofuscin in retinal pigment epithelial cells // Antioxidants. – 2023. – Vol. 12, No. 2. – P. 413. doi: 10.3390/antiox12020413.

27. Dysli C., Wolf S., Berezin M.Y., Sauer L., Hammer M., Zinkernagel M.S. Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy // Prog. Retin. Eye Res. – 2017. – Vol. 60. – P. 120–143. doi: 10.1016/j.preteyeres.2017.06.005.

28. Eldred G.E., Katz M.L. Fluorophores of the human retinal pigment epithelium: separation and spectral characterization // Exp. Eye Res. – 1988. – Vol. 47. – P. 71–86. doi: 10.1016/0014-4835(88)90055-2.

29. Sparrow J.R., Wu Y., Kim C.Y., Zhou J. Phospholipid meets all-trans retinal: the making of RPE bisretinoids // J. Lipid Res. – 2009. – Vol. 51. – P. 247–261. doi: 10.1194/jlr.R000687.

30. Miura Y., Bernstein P., Dysli C., Sauer L., Zinkernagel M. Fluorophores in the eye // In: Zinkernagel M., Dysli C. (eds). Fluorescence Lifetime Imaging Ophthalmoscopy. – Cham: Springer International Publishing, 2019. – P. 35–48. doi: 10.1007/978-3-030-22878-1_7.

31. Sonntag S., Klein B., Brinkmann R., Grisanti S., Miura Y. Fluorescence lifetime imaging ophthalmoscopy of mouse models of age-related macular degeneration // Transl. Vis. Sci. Technol. – 2024. – Vol. 13. – P. 24. doi: 10.1167/tvst.13.1.24.